简介：医源性早产胎膜早破仍然是胎儿镜检查的致命弱点。本研究的目的是展示通过应用带有伞状受体的组织胶水来封闭胎膜（FM）缺损在体内的可行性天宇优配。
方法：首先，我们调整了先前描述的体外策略，并通过将聚四氟乙烯或硅树脂封装的镍钛诺胶水受体与人类胎膜进行粘合，评估了不同组织胶水（组织胶水 Histoacryl® 和 Glubran2®）的粘附强度。然后，我们通过剖腹手术暴露怀孕母羊的子宫，并将一个 10 号法式套管针置入羊膜腔，通过该套管针插入伞状胶水受体（n = 9），并用组织胶水（n = 8）将其固定在胎膜上。在手术后 4 小时评估封闭缺损处的密封性。
结果：所测试的两种组织胶水在体外均使胶水受体粘附到胎膜上。在体内，所有胶水受体（n = 9）均在羊膜腔内打开，并且所有成功放置的胶水受体都封闭了胎膜缺损（n = 8）。手术后 4 小时，2 个治疗部位显示出轻微渗漏，而未使用胶水的阴性对照组（n = 1）则出现了大量渗漏。
讨论：这项体内研究证实，通过应用组织粘合剂可以封闭胎儿镜检查引起的胎膜缺损。
一、简介
如果在怀孕期间发现胎儿或胎盘异常，胎儿手术可提供改善生命或挽救生命的选择。目前，这些产前干预措施根据适应症，要么通过切开子宫进行，要么通过胎儿镜检查实施。例如，胎儿镜激光手术已成为治疗双胎输血综合征的标准方法（图 1）。尽管在治疗结果方面前景广阔，但这些手术也存在自身的一系列问题。在手术过程中，每个进入部位都会在胎膜（FM）上造成一个无法自发愈合的缺损。根据手术类型、所用端口的数量和直径以及 “胎膜早破” 的定义，在所有胎儿镜检查中，这些缺损会导致 30% 至 100% 的医源性早产胎膜早破（iPPROM）。研究人员尝试了许多不同的方法，如粘合剂、贴片或不同的堵塞物来封闭这些缺损，以降低 iPPROM 的发生率，但目前由于这些方法存在不稳定性、副作用或无效性，没有一种方法在临床上得到常规使用。一些研究将密封剂视为封闭缺损的一种选择。仍然有待解决的一个主要挑战是将这些密封剂输送到缺损部位的方法。我们之前展示了一种在体外环境中，通过胎儿镜检查端口使用伞状胶水受体作为贴片来输送密封粘合剂的方法。这种方法能够以微创的方式精确输送粘合剂，封闭缺损，并有可能稳定胎膜。
展开剩余89%在这里，我们改进了该装置，并研究了在体外能提供足够粘附强度的生物粘合剂和材料的最合适组合。然后，我们在怀孕母羊模型上进行了该装置的体内应用，以证明该方法的潜力。
二、材料与方法
01. 胎膜缺损微创封闭装置
0101. 涂抹器和注射器
我们之前描述过一种用于在胎儿镜检查干预后预防性封闭胎膜缺损的装置。该装置包括一个胶水受体、一个用于引入胶水受体的涂抹器，以及一个用于在羊膜腔内输送粘合剂的注射系统。胶水受体设计为直径 20 毫米的伞形，以便优化折叠，伞的凹面朝向胎膜。伞的边缘是圆形的，以防止损伤胎膜，并确保胶水在胶水受体表面的最佳分布。伞由镍钛诺制成，这赋予了它超弹性特性，使其能够折叠进一个 10 号法式导管中，并在推入羊膜腔时自动展开。为了让外科医生能更好地使用该装置，我们对其进行了改进（图 1）。伞状胶水受体被装入一个外径为 3.20 毫米、内径为 3.00 毫米的不锈钢管中。该管可在用于胎儿镜检查干预的 10 号法式鞘管导入器（蓝色，Check-Flo Performer® 导入器）中自由滑动。另一个外径为 2.90 毫米、内径为 2.70 毫米的不锈钢管用于推动和弹出伞状胶水受体。伞状胶水受体通过可降解缝合线连接到推动管上，以使伞状胶水受体与涂抹器保持连接。一个注射器连接到一个外径为 1.00 毫米、内径为 0.50 毫米的管上，该管插入第二个金属管中。一旦伞状胶水受体就位并贴靠在胎膜上，就用它来注射粘合剂（图 1 中绿色部分）。完成此操作后，使用者能够通过一个锁定系统释放其与涂抹器的连接。上述元件集成在一个定制的手柄中，可单手操作。所有部件都在洁净室中组装，并通过高压灭菌器进行灭菌。
图1. 先前描述的装置经过调整，以便在手术过程中更易于操作。所有功能都集成到一个称为涂抹器的装置中。a, b 涂抹器通过先前穿过子宫壁置入羊膜腔的 10 号法式鞘管导入器插入。c, d 然后受体在腔内展开并贴靠在胎膜上。e, f 此时，外科医生从外部涂抹粘合剂，并将受体平压在胎膜上。FM，胎膜。
0102. 用于收集密封材料的伞状胶水受体
伞状胶水受体由框架和涂层组成。框架是由厚度为 200 微米的镍钛诺薄片激光切割并定型而成。这种超弹性材料使其能够卷曲进一个适合 10 号法式鞘管导入器的管子中，并在推入羊膜囊时自动展开。聚四氟乙烯（PTFE）和硅树脂被用作涂层选项进行测试。聚四氟乙烯涂层是由两片静电纺丝片材，使用热塑性材料围绕镍钛诺框架层压在一起制成。硅树脂片材通过浸涂法放置在框架上。
0103. 生物粘合剂
基于先前对胎儿镜检查中潜在粘合剂的研究，我们选择了两种粘合剂 。两者都是基于氰基丙烯酸酯的粘合剂，具有 CE 标志，并在体内用于其他适应症，如腹股沟疝修复手术中的网片固定。它们被选中是因为它们具有很强的粘合能力，并且在接触潮湿环境时（1-2 秒）固化速度很快。在我们所有的实验中，粘合剂都是从安瓿转移到注射器中进行使用。
0104. 人类胎膜
人类胎膜是在得到苏黎世地区伦理委员会（研究 Stv07/2007）的决定后，从患者处获得书面同意后收集的。胎膜在足月剖腹产（37 至 39 周之间）后采集，储存在氯化钠溶液中，并在收集当天使用。所有胎膜都经过筛选，排除了 HIV、乙型肝炎、糖尿病和衣原体感染。
0105. 伞状胶水受体对完整胎膜的粘附强度天宇优配
将新鲜、完整的胎膜，羊膜面朝上，在一个表面上展平以去除褶皱，放在一个盘子上，并用一个直径 8 厘米的铝制圆柱体夹住（图 2），尽量减少胎膜的拉伸。用 0.9% 的生理盐水溶液保持胎膜湿润。在伞上添加一个小环，以便将它们从胎膜上拉开。使用 200 微升的移液管在伞下添加 100 微升的生物粘合剂，然后将伞压下，以模拟装置对羊膜的拉力。为了确保生物粘合剂能够在潮湿环境中固化，将 0.9% 的生理盐水溶液倒在模型上。将伞压在羊膜上 1 分钟，然后总共放置 15 分钟，以确保胶水完全聚合。然后，使用测力计通过连接的环拉动伞，直到它从羊膜上松开，从而量化粘附强度。这个过程是用由硅树脂和聚四氟乙烯制成的伞，分别与两种粘合剂组合进行的（每组 n = 3），因为在我们之前的研究中，它们对胎膜的粘附力明显高于纤维蛋白胶。所有粘附强度测试的值都使用 IBM SPSS Statistics 上的 Kruskal-Wallis 检验进行单因素方差分析，以判断统计显著性。当 p < 0.05 时，认为具有统计显著性。
图2. 粘附强度测试实验装置。a 胎膜被羊膜面朝上夹在铝制圆柱体中。b 粘合剂被注入受体的凹面部分，将其填满，如图 c 所示。d 伞状受体被平放，以最小化胶层并最大化粘附强度。这一步骤是通过放置在胎膜下方的塑料板实现的。e 然后用测力计测量粘附强度，以测量破裂时的力，如图 f 所示。FM，胎膜。
02. 怀孕母羊模型的胎膜缺损封闭程序
0201. 动物处理
动物饲养以及所有程序和方案均已获得瑞士苏黎世州兽医办公室的批准，许可证编号为 ZH214/18。饲养和实验程序符合瑞士动物保护法，并符合欧洲议会和理事会 2010 年 9 月 22 日关于保护用于科学目的的动物的第 2010/63/EU 号指令以及《实验动物护理和使用指南》。
本研究使用了两只经产的瑞士白阿尔卑斯母羊（妊娠期分别为 73 天和 79 天）。两只母羊都怀有双胞胎。
母羊通过静脉注射盐酸氯胺酮，同时配合咪达唑仑和丙泊酚进行麻醉。插管后，通过正压通气（新鲜气体流量 1-1.5 升 / 分钟，呼吸频率 12-15 次 / 分钟，潮气量 5-10 毫升 / 千克，吸入氧浓度 0.5），使用异氟醚（2-3%）在氧气 / 空气混合物中维持麻醉。术前通过静脉注射阿莫西林 / 克拉维酸进行抗生素治疗。在整个干预过程中，通过持续输注舒芬太尼和氯胺酮来确保镇痛效果。在手术区域进行罗哌卡因浸润阻滞。在手术期间，以约 5 毫升 / 千克 / 小时的输注速率静脉输注林格氏液进行液体补充。
手术后并完成数据收集后，用戊巴比妥钠对母羊实施安乐死（75 毫克 / 千克体重）。用戊巴比妥钠（75 毫克 / 千克体重）通过脐静脉或心内注射对胎儿实施安乐死。
0202. 手术和封闭程序
手术过程中，母羊处于仰卧位。进行脐下中线剖腹术以暴露子宫。在子宫角的末端插入一个腹腔镜端口，用于插入摄像头。注入林格氏液以填充腔体，增加可见度，并使胎膜能够被最佳地穿刺。为了模拟胎儿镜检查干预，然后将一个 10 号法式套管针安装在一个闭孔器上，并以 45 度角穿过子宫壁插入羊膜囊。将伞状胶水受体用手卷曲并推入上述涂抹器中。然后将涂抹器插入 10 号法式套管针中。观察插入的成功率。在内窥镜引导下，将伞状胶水受体从装置中推出进入羊膜腔，并拉向羊膜。记录伞状胶水受体展开的成功率。为了确保胶水受体完全充满，通过连接到注射器的注射入口向伞状胶水受体中注入 400 微升的粘合剂。聚合 20 秒后，松开伞并取出涂抹装置，使伞粘在羊膜的内侧。由于在潮湿的子宫表面很难测量泄漏量，并且流量取决于羊膜囊的压力和体积，因此在植入后直接通过肉眼观察定性评估羊水泄漏情况。每个子宫角总共放置 4-5 个植入物。总共插入并展开了 9 个植入物。在这 9 个中，1 个用作阴性对照，即在伞不与羊膜接触的情况下将胶水注入羊膜腔。其他 8 个装置正确放置在胎膜上。其中，2 个是硅树脂与一种粘合剂的组合，3 个是聚四氟乙烯与该粘合剂的组合，3 个是聚四氟乙烯与另一种粘合剂的组合。它们的组合以随机顺序进行，以尽量减少训练对结果的影响。在麻醉 4 小时后，将普通牛奶注入羊膜腔，以观察植入部位是否有潜在的泄漏。然后对母羊和胎儿实施安乐死，并收集组织样本进行组织学分析。
三、结果
01. 伞状胶水受体对完整胎膜的粘附强度
为了验证粘合剂和伞状胶水受体的使用效果，在体外测量了粘附强度。这些粘附力测量结果显示，不同组内和组间存在很大差异（图 3）。硅树脂伞与其中一种粘合剂的组合显示出最大的粘附强度（14.67±7.05 千帕）。聚四氟乙烯伞与两种粘合剂的粘附强度相似（分别为 11.44±6.9 千帕和 10.5±3.3 千帕）。硅树脂与另一种粘合剂的组合显示出最小的粘附强度（7.9±1.8 千帕）。各组之间未观察到显著差异（p = 0.62）。
图3. 在体外模型中，用两种粘合剂粘合的伞状受体的粘附强度（所有组合的 n = 3）。PTFE，聚四氟乙烯。
02. 怀孕母羊模型的胎膜缺损封闭程序
0201. 体内缺损封闭
在体外评估粘附强度后，下一步是评估伞在体内是否能够精确应用。在植入前两分钟，将伞状胶水受体卷曲并装入插入管中，然后将其推入 10 号法式鞘管导入器中。虽然聚四氟乙烯涂层的胶水受体在所有情况下（n = 7；100%）都能轻松变形并保持完整，但硅树脂涂层的伞很脆，卷曲时会导致硅树脂开裂并形成孔洞，这损害了它们收集胶水的能力。6 个硅树脂涂层的胶水受体中，有 2 个（33%）成功装入且未损坏其涂层。图 4a-f 显示了内窥镜记录的其中一个伞状胶水受体的应用步骤。装入的伞状胶水受体的插入和展开在所有情况下都成功（n = 9，展开的胶水受体的 100%）。一个聚四氟乙烯涂层的胶水受体用作阴性对照。在这里，在正确定位伞之前故意涂抹了胶水。在这种情况下，观察到了羊水泄漏。所有其他伞状胶水受体（6 个聚四氟乙烯的，2 个硅树脂涂层的）都能正确定位在缺损处，并且注射组织胶水导致胶水受体稳定地固定在羊膜上（n = 8，胶水受体的 100%）。在 8 个植入物中的 2 个中，在子宫表面观察到轻微的牛奶流动（图 4h，i 黄色箭头），这两个都是用一种粘合剂粘合的聚四氟乙烯覆盖的伞。其中一个显示泄漏的装置在植入下一个伞时已经脱落，但没有损坏。其他 6 个胶水受体（3 个聚四氟乙烯与一种粘合剂的组合，1 个聚四氟乙烯与另一种粘合剂的组合，以及 2 个硅树脂与该另一种粘合剂的组合）继续显示出密封不透水（粘合的胶水受体的 75%，图 4i 黄色星号）。
图4. 伞状受体的体内微创植入。a-f 装置的植入步骤。在 a 中，用套管针对子宫进行穿刺，如图 b 所示，该套管针用于滑动并放置 10 号法式导管。在 c 中，取出套管针以便能够插入涂抹器，并在 d 中引入伞。在 e 中，伞展开，并在 f 中粘在羊膜上。g 实验装置。子宫暴露，外科医生用一只手握住 10 号法式导管（蓝色管）进行操作。h 泄漏测试。通过内窥镜端口注入牛奶（图像左侧）。i 术后 4 小时缺损的泄漏（黄色箭头）和紧密密封（黄色星号）（植入了 8 个伞）。j 植入后和 4 小时后密封和泄漏的植入物数量总结。
在某些情况下，在缺损周围的子宫表面观察到了聚合的粘合剂。用于将伞拉向并固定在胎膜上的缝合线在外部也仍然存在且可见。此外，在手术期间未监测到任何并发症或母羊和胎儿的痛苦迹象，并且两只羊的生命体征在安乐死前保持稳定。
四、讨论
在本研究中，我们测试了我们先前开发的用于封闭怀孕母羊胎膜缺损的微创装置。为此，我们用临床认可的材料对伞状胶水受体进行了涂层，并在体外和体内使用不同的组织胶水优化了它们对胎膜的粘附力。我们成功地实现了伞状胶水受体的非常可靠的展开（100%），并且在术后 4 小时，它们对胎膜的粘附力在大多数情况下（75%）被证明是密封不透水的。此外，我们在使用不同类型的氰基丙烯酸酯粘合剂时没有发现显著差异。最后，我们认识到硅树脂不太适合用于我们的装置，因为在输送装置中卷曲时多次观察到硅树脂破裂。总体而言，我们的工作代表了将这项技术转化为临床应用的重要一步。
01. 伞状胶水受体对完整胎膜的粘附强度
到目前为止，不同胶水的粘附强度仅在干燥的胎膜和用一种Degrapol®（非 CE 标志材料涂层） 的伞上进行过检查。在这里，为了将我们的技术推向临床应用，我们依赖于不同的临床认可的粘合和涂层材料。此外，为了模拟体内条件，我们在潮湿环境中进行了体外实验，通过提供氢氧根离子来支持氰基丙烯酸酯的聚合。两种粘合剂对聚四氟乙烯和羊膜的强粘附力非常有前景。虽然聚四氟乙烯与两种粘合剂的粘附强度相当，但使用其中一种粘合剂时测量的变异性较低。在另一项动物研究中比较两种粘合剂的一篇出版物中，先前曾报道过这些相似的粘附特性。然而，必须记住，一项体外研究表明，在接触一种粘合剂后，组织学分析中羊膜层的上皮受到破坏。潜在原因可能是该粘合剂的热诱导反应和 / 或组织学分析的包埋程序，需要进一步研究。尽管在粘附强度方面取得了非常有前景的结果，但硅树脂涂层的伞应在进一步实验中不予考虑，因为它们被发现明显更脆，在将它们装入应用装置的过程中，66% 的伞出现了损坏。
东莞市富临塑胶有限公司是Degrapol在中国的代理商，富临塑胶为中国客户提供植入级可吸收聚氨酯Degrapol。
02. 怀孕母羊模型的胎膜缺损封闭程序
先前已经开发了其他应对早产风险的方法，但没有一种达到临床标准。一些综述总结了其他预防 iPPROM 的方法的发展及其优缺点。例如，已经测试了血小板和冷沉淀（羊膜贴片）的应用，但需要额外的穿刺、缺乏精确的沉积，以及据报道由于血小板的血管活性作用导致的胎儿死亡，可能解释了到目前为止结果存在疑问的原因。有前景的替代方法，如胶原塞或脱细胞羊膜也进入了动物和人体的体内研究。尽管在兔子模型中取得了令人鼓舞的结果，但胎膜并未再生，并且在人体中，未观察到 iPPROM 的减少。其原因可能是由于胶原塞的快速降解，缺乏长期的机械支持和穿刺的紧密性。这也可能导致对降解的生物材料的副作用。同样，纤维蛋白密封剂的应用没有提供长期支持，并且在为缺损提供稳定性方面存在不足。贻贝仿生胶被证明是一种在潮湿环境中工作的有前途的替代粘合剂候选材料。本研究未使用它，因为它是一种双组分胶水，使得控制聚合更加困难，并且它不被医学使用所接受。依赖于刺激信号来再生胎膜并满足预防 iPPROM 要求的促愈合材料，处于非常有前途的发展状态，值得进一步研究。同样，其他替代方法，如在先前插入缺损的冻干胎膜上应用纳米二氧化硅填充的粘合剂凝聚层，在体外显示出良好的密封性能。然而，在临床上使用此类材料的开发和监管之路仍然漫长而艰难。此外，基于注射材料的方法依赖于在穿刺的确切部位进行微创沉积，这是一个到目前为止尚无解决方案的重要挑战。
其他外科领域也遇到了类似的问题，并为我们的发展提供了灵感。例如，在心脏手术中，有的技术使用微创介入技术来封闭静脉入口部位。他们的系统通过在血管壁上应用胶原贴片来实现体内平衡和缺损的封闭，这得益于血管腔内的固定元件才得以实现。我们的方法采用了类似的原理，其中羊膜腔内的伞状胶水受体充当了可注射强力粘合剂的容器。其目的是在缺损处形成密封不透水的密封，并在不依赖胎膜愈合的情况下机械地固定胎膜。
在我们之前的出版物中展示了首次体外概念验证之后，我们装置的改进版本在体内实现了伞状受体可靠且可重复的植入。我们的结果表明，如果正确植入，这种方法可用于以微创方式封闭缺损。术后 4 小时在 8 个装置中的 6 个中观察到的密封不透水证明了这一点。此外，结果表明，尽管有 2 个聚四氟乙烯与一种粘合剂的组合发生了分离，但两种粘合剂的表现同样良好，而这种分离并非由于粘合剂的粘附强度，而是由于应用错误。至于出现泄漏的 2 个装置，其中 1 个在植入下一个伞时脱落，原因是下一个伞放置得离它太近，并且受到了粗暴的机械处理。另一个泄漏是由于在伞贴靠在胎膜上之前过早注射了胶水，这由于伞内胶水的量不足而导致粘附力较弱。
由于羊的解剖学特殊性，人类中可能出现的其他潜在问题，如羊膜 - 绒毛膜分离，无法进行评估。然而，在我们的研究中，确认了胎儿和母羊两者的存活情况。将这种技术应用于临床的道路需要大量的工作来进一步改善结果。一方面，需要改进胶水的应用，以防止羊膜腔内的泄漏。此外，必须优化胶水的用量，以尽量减少粘合剂在子宫表面的潜在溢出。另一方面，需要进行安全性测试，评估胶水对胎儿、母羊和周围组织的毒性。为此，我们计划进行长期动物研究，对羊进行手术，使其苏醒，并在几天后处死。通过这种方式，我们将能够分析所应用的外来材料对宿主和胎儿组织的长期生物学影响。
五、结论
本研究证实，我们先前建立的用于预防性封闭胎儿镜检查引起的胎膜缺损的微创方法，在与临床相关的母羊模型中是适用的。接下来，需要评估密封贴片的长期体内性能，以评估其临床转化的潜力。
东莞富临医疗科技有限公司是Degrapol在亚洲的代理商， 为亚洲客户提供植入级可吸收聚氨酯Degrapol公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
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